产品描述

cAMP Detection Kit可用于检测细胞中cAMP的水平。试剂盒中有一株抗体识别cAMP，标记荧光供体Eu (Anti-cAMP-Eu)；cAMP上标记荧光受体A2 (cAMP-A2)。

在溶液中，Anti-cAMP-Eu与cAMP-A2结合，可发生荧光共振能量转移(FRET)，使用320 nm的光激发荧光供体Eu，Eu供体发射620 nm的光，此620 nm的光激发荧光受体A2，A2受体发射出665 nm的光。细胞裂解后，细胞内产生的的cAMP被释放到裂解液样本中，会竞争结合Anti-cAMP-Eu，破坏FRET现象。待测细胞中cAMP的浓度与FRET的信号值(665 nm/620 nm的光强度比值)成反比。

产品特点

兼顾窗口和灵敏度：检测窗口大，同时灵敏度高

应用场景广泛：可用于Gs或Gi通路

省时省力：操作步骤简单，节约时间

高通量：搭配自动化设备，实现高通量检测

检测原理

产品组分

储存条件

试剂盒于-30 ~ -15℃保存，≤0℃运输。

▲ cAMP Standard、Anti-cAMP-Eu和cAMP-A2于-30 ~ -15℃保存，首次使用时，请按需分装，避免反复冻融；

▲ Stimulation Buffer和Lysis Detection Buffer于-20 ~ 4℃保存。

Q1. 什么是TR-FRET？

A1. TR-FRET（时间分辨-荧光能量共振转移，Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer）是一种结合了 时间分辨荧光检测（TRF）和荧光共振能量转移（FRET）的均相检测技术。其核心是以镧系金属元素（如铕Eu）作为供体荧光团，将能量转移至受体，通过检测供体和受体发射的特定波长信号，分析生物分子间的相互作用。

Q2. TR-FRET的主要优势是什么？

A2. 优势如下：

1. 高通量：适配高通量应用场景，可搭配自动化平台；

2. 均相检测：无需洗涤或分离步骤，操作简便，只需加样-孵育，即可上机检测；

3. 高灵敏度：时间分辨荧光检测减少了背景噪声，提高了信噪比；

4. 节省样本：总体系仅20μl。

Q3. 如何设置延迟时间和测量时间？

A3. 可参照以下内容：

1. 延迟时间（Delay Time）：通常设为50-100μｓ，用于过滤其他背景荧光值；

2. 测量时间（Integration Time）：建议200-500μｓ，确保足够信号采集。

注：不同试剂盒可能推荐不同参数，需参考说明书。

Q4. 激发和发射波长如何选择？

A4. 供体激发波长：根据供体荧光团（如铕Eu：320/340 nm）;

发射波长：供体（如铕Eu）发射波长为620 nm；受体（如d2）发射波长为665 nm。

注：需确保仪器滤光片匹配，避免交叉干扰。

Q5. TR-FRET实验中如何选择微孔板？

A5. 板型选择：通常使用黑色或白色96孔或384孔板:

黑色板：减少孔间光串扰，适合高灵敏度检测；

白色板：增强信号强度，适合低信号检测；

板底类型：根据检测模式选择平底或圆底板。

Q6. 信号值过低或无信号。

A6. 可能的原因如下：

1. 试剂失效（如抗体失活）；

2. 样本浓度过低（需优化稀释比例）；

3. 仪器参数错误（如波长、延迟时间设置错误）；

4. 孔板选择错误（需使用不透明的浅孔板进行检测）；

5. 酶标仪配置问题（需与仪器工程师确认）。

Q7. 背景信号过高如何解决？

A7. 参考以下内容：

1.检查样本中是否含有自发荧光物质（如血红素）；

2.存在非特异性结合，适当调整孵育时间，减少非特异性结合。

Q8. 孔间信号波动大（CV>20%）的可能原因？

A8. 可能是以下原因导致：

1. 加样误差（建议使用多通道移液器）；

2. 孔板边缘效应（避免使用边缘孔或预平衡板温湿度）；

3. 试剂未充分混匀（离心后震荡混匀）；

4. 确保微孔板放置正确。

Q9.若样品浓度范围较小，是否可将标曲高点删去？

A9. 不建议，标曲删点可能会导致检测结果的精密度和准确度发生变化，可通过加标回收验证差异大小是否在误差接受范围内。

Q10. 荧光供体和荧光受体在体系中加入的量是否需要严格限制？

A10. 体系中荧光供体和荧光受体的含量通常是按照说明书1:1等比例加入，若需放大或缩小体系，一般建议体系中所有组分等比例调整。

Q11. 在荧光供体采用Eu（cryptate）的反应体系中，为什么需要使用含KF（氟化钾）的buffer？

A11. 在TR-FRET反应体系中，KF可以帮助降低Eu（cryptate）的背景荧光噪声，起到稳定信号的作用。

Q12. 配制好的标曲是否可以重复使用？

A12. 不建议重复使用。因为每次加样的环境和操作均存在差异，重复使用不能保证后续环境因素和操作手法与之前完全保持一致，为避免产生误差，不建议重复使用。

Q13. 实验当天荧光供体和荧光受体配制多了，可以冻存起来，后续再次使用吗？

A13. 建议现配现用，已经配制好的供受体浓度较低（1×），反复冻存使用会影响产品性能稳定性。

Q14. 孵育时间必须是两小时吗，是否可以延长？

A14. 在做好防挥发和防污染的措施后，24小时内均可重复测板。

Q15. 加样孵育过程中是否需要注意避光？

A15. 无需避光，注意体系不被污染并做好防挥发措施即可。

Q16. 加样过程中出现气泡会影响检测结果吗？

A16. 体系中气泡过多会影响荧光检测结果，但在孵育过程中，大多数较大的气泡会自行消去，小气泡可能无法完全消除，因此在点样操作时建议轻柔吹打，避免产生气泡影响读值或出现复孔差异大的情况。

Q17. 使用不同的微孔板（如白色不透明浅孔板和黑色不透明浅孔板），光值检测结果差异大，是否对体系有影响？

A17. 不同颜色、材质的板材最终反映出来的信号值是不同的，比如黑色板和白色板的吸光性就不同，建议选定一种板材使用即可。