基本信息

题目：Study on the Characterization and Degradation Pattern of Circular RNA Vaccines Using an HPLC Method

期刊：Chemosensors

单位：中国食品药品检定研究院生检所肝炎室、南京诺唯赞生物科技股份有限公司等

Vazyme 合作产品：Bsal限制性内切酶(GMP4303PC)、T7 RNA合成高产试剂盒(DD4201)、DNaseⅠ(GMP4104PC)、RNase R

研究背景

随着mRNA疫苗技术的发展，mRNA领域内的新兴技术也是日新月异，尤其是像环状RNA、自复制RNA等研究和应用受到了前所未有的关注。环状RNA作为一种特殊的RNA，从其被发现以来研究者们逐渐认识到它可以作为蛋白翻译表达的载体。并且由于其在体内的稳定性显著优于常规mRNA，在治疗性药物场景环状RNA具有显著的应用优势。但我们也无法忽视环状RNA作为一种新兴的技术路线，还存在一些技术和工艺的瓶颈有待突破。已有研究发现通过耐高温T7突变体可以突破高效率合成环状RNA瓶颈的研究^[1]。另外一个技术瓶颈则是在合成产物分析及相关杂质鉴定方法方面，缺乏相关研究。

内容概述

2024年7月，中国食品药品研究检定院肝炎病毒疫苗室和诺唯赞公司生物医药研发团队合作在线发表题为“Study on the Characterization and Degradation Pattern of Circular RNA Vaccines Using an HPLC Method (利用HPLC方法研究环状RNA疫苗的鉴定和降解模式)”的研究^[2]。该研究中讨论了环状RNA工艺中容易被忽略的开环RNA、环状RNA聚集体等杂质，尤其是针对开环RNA开发了反相HPLC的方法，能够很好的分离鉴定开环RNA这一关键杂质。

研究思路与成果

01 建立反相HPLC方法分析环状RNA杂质

研究者首先利用IVT方法分别合成线性前体RNA、环状RNA和开环RNA(通过模板设计实现)这几种环状RNA的关键组分和杂质。实验发现常规的毛细管电泳手段基本上无法优先区分这几种成分。为了能够有效的分离鉴定这几种成分，作者通过对反相HPLC方法进行优化，最终实现了线性前体、环状以及开环RNA的检测鉴定。同时还优化了SEC-HPLC方法，使其能够很好的检测出环状RNA样品中的聚集体杂质。

图1 建立高效液相色谱方法来确认环状RNA的组分。线性前体RNA、环状RNA、开环RNA和切除的内含子的示意图及预期大小(A)，并分别通过毛细管电泳(B)、反相高效液相色谱(RP-HPLC)和分子筛色谱法(D)测定^[2]

02 环状RNA的杂质演变分析

除环状RNA制备中的杂质分析鉴定外，核酸杂质在储存过程中的降解演变也是一个未解之谜。作者利用以上建立好的RP-HPLC和SEC-HPLC方法，对于不同温度条件下储存的环状RNA进行分析，来获得其杂质的降解演变路径。实验结果显示环状RNA遵循“环状-开环-降解碎片”的路径，同时聚集体在高温下随时间增加，低温下容易随样品一同降解。

图2 热加速条件下环状RNA的稳定性研究，使用RP-HPLC分析4℃(A)，25℃(B)，和37℃(C)3种条件下环状RNA的降解模式。同时总结了HPLC、SEC和CE在不同条件下的稳定性研究数据(D)^[2]

03 环状RNA产品杂质的生物学活性

对于以上鉴定出的杂质，作者进一步探究了其生物学表达活性和免疫原性。研究表明除了环状RNA正常翻译表达之外，开环和聚集体杂质具有微弱的表达活性，线性前体和降解片段完全不会表达。作者将这些组分分别进行LNP包封后进行小鼠体内免疫原性的研究，结果表明未纯化的环状RNA (Circular)、开环RNA相对具有较高的免疫原性，纯化后的环状RNA、聚集体、降解碎片免疫原性相对较低。

图3 环状RNA不同杂质的免疫原性检测。细胞转染24 h后使用共聚焦显微镜观察结果，并计算各组EGFP阳性细胞百分比^[2]

04 结论

该研究集中在对环状RNA疫苗相关核酸杂质的分析和鉴定以及杂质的降解演变上，对于其中的开环、聚集体杂质开发建立了有效的分析方法。通过对环状RNA中这些杂质的降解演变路径的分析，以及杂质生物学活性分析，为环状RNA药物的进一步发展提供了科学武器。

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参考文献：

[1] Wei He,Xinya Zhang,Yangxiaoyu Zou,Ji Li,Chong Wang,Yu Cai He... & Jianren Ye.(2024).Effective Synthesis of High-Integrity mRNA Using In Vitro Transcription. Molecules

[2] Feiran Cheng, Ji Li, Chaoying Hu, Yu Bai, Jianyang Liu, Dong Liu, Qian He, Qiuheng Jin, Qunying Mao, Zhenglun Liang and Miao Xu. Study on the Characterization and Degradation Pattern of Circular RNA Vaccines Using an HPLC Method. Chemosensors 2024, 12, 120.